فایل word بررسی ساختمان و عملکرد لیزوزوم و میکروبادی

    —         —    

ارتباط با ما     —     لیست پایان‌نامه‌ها

... دانلود ...

بخشی از متن فایل word بررسی ساختمان و عملکرد لیزوزوم و میکروبادی :

ساختمان و عملکرد لیزوزوم و میکروبادی

اطلاعات ما راجع به ساختمان و عمل لیزوزومها و میکروبادیها نسبت به بقیه ارگانل های سلولی بسیار جدید و در سنوات اخیر کسب شده است .اگر چه اجسام کوچک گوناگون موجود در سلولهای گیاهی جانوری به اسامی متفاوتی از قبیل میکروبادی و سیتوزوم نامیده می شدند و لی تنوع ساختمان و عمل آنها تا دهه 1950 شناسایی نشده بود. کشف لیزوزوم و میکروبایدها در خلال دهه 50 را می توان در رابطه با تکامل روشهای میکروسکوپ الکترونی و جز جز کردن و تفکیک عناصر سلولی دانست . در عصر حاضر لزوزومها به عنوان یک ارگانل مستقل شناسایی شده در صورتی که پراکسیزومها و گلی اکسیزومها Peroxisome and glayoxysome)) و ارگانل های وزیکولار دیگری مربوط به آنها می شوند . جمیعاً میکروبادی نامیده می‌شوند .

وجود لیزوزوم اولین بار در اوایل دهه پنجاه توسط دیدوChristian de Duve و همکارانش پس از یک سری آزمایشات مفصل به اثبات رسید . این آزمایشات برای مشخص نمودن محلهای درون سلولی دو آنزیم به نامهای گلوکز -6- فسفاتاز و اسید فسفاتاز طراحی شده بود . هموژنات بافت کبد را توسط سانتریفوژ تمایزی به جز ‌های هسته‌ای , میتوکندریایی , میکروزومی و سیتوپلاسمی تفکیک نمودند و هر کدام از این قسمت ها را برای مشخص نمودن محتویات آنزیمی آن مورد آزمایش قرار دارند . در مورد گلوکز -6- فسفاتاز آزمایشات به وضوح مشخص نمود که این آنزیم به ذراتی که با جز میکروزومی رسوب می نمایند باند شده است , ولی در مورد اسید فسفاتازها در ابتدا استنباط مشخصی را مقدور نمی ساخت به خاطر اینکه ؛

1) فعالیت اسید فسفاتاز در صورتی که هموژنات با همگن ساز یا هموژنیزر (homogenizer) به آرامی تهیه شده باشد یک دهم زمانیست که برای تهیه هموژنات از روشهای قوی تری ,نظیر به کارگیری مخلوط کن , استفاده نماییم.

2) کل فعالیت آنزیمی جز های جدا شده پس از سانتیفیوژ تمایزی دو برابر فعالیت هموژنات اصلی بود و

3) پس از چند روز نگهداری در فریزر , فعالیت آنزیمی کل هموژنات و همچنین فعالیت جز های جدا شده , علی الخصوص جز میتوکندریایی افزایش قابل ملاحظه‌ای را نشان می داد . این نتایج در جدول 1-8 خلاصه شده است .

جدول 1-8 فعالیت آنزیمی اسید فسفاتاز در جز های سانتریفیوژی بافت کبد که توسط سانتریفیوژ تمایزی تهیه شده اند .

فعالیت اسید فسفاتاز (1)

جز مورد آزمایش

قبل از ذخیره کردن در فریزر

بعد از ذخیره کردن بمدت 5 روز

کل هموژنات

10

89

جز هسته‌ای

2

10

جز میتوکندریایی

7

46

جز میکروزومی

6

10

جز محلول

6

9

(1)‌مقدار فسفات آزاد شده , به میکروگرم در مدت 20 دقیقه

این مشاهدات زمانی توجیه گردیدند که دید و همکارانش نشان دادند که فعالیت اسید فسفاتاز محدود به ذرات قابل رسوبی می باشد که غشا محدود کننده آنها مانع دستیابی سوبسترا به اسید فسفاتاز می گردد .

صرفاً زمانی که این غشاهای محدود کننده پاره شوند و اسید فسفاتاز از ذرات آزاد گردد فعالیت آنزیمی مشخص و ظاهر می شود . این امر زمانی میسر می گردد که برای تهیه هموژنات , بافت را به وسیله مخلوط کن شدیداً خرد نماییم , در صورتی که استفاده از هموژنیز تنها باعث انهدام 10 درصد از ازت محتوی اسید فسفاتاز شده , و فعالیت پایین آنزیمی را سبب می گردد .

در ابتدا دید و همکارانش موفق به تشخیص این مسئله که آنزیم با یک گروه مشخصی از ذرات سلولی در ارتباط می باشد نشدند , بلکه بر مبنای افزایش فعالیت آنزیمی جز میتوکندریایی چنین تصور می کردند که اسید فسفاتاز بایستی در میتوکندریها وجود داشته باشد . بهر حال ادامه مطالعات در اوایل دهه پنجاه که در آن جز میتوکندریایی را توانستند به چندین زیرجز دیگر تقسیم نمایند مشخص ساخت که اسید فسفاتاز به گروه خاصی از ویزکولهای سلولی که جدا از میتوکندریها می باشند مربوط بوده است . مقارن با این وقایع چهار نوع دیگر از هیدرولازهای اسیدی به نامهای بتا – گلوکورونیداز ((, کاتپسین (Catepsin) , اسید ریبونوکلئاز (acid ribonuclease) و اسید دی اکسی ریبونوکلئاز(acid deoxyribonuclease) کشف گردیدند که همگی به نحو یکسانی با اسید فسفاتاز در جز های سانتریفیوژی توزیع شده بودند.

بنابراین 5 آنزیم هیدرولیتیک که همه دارای pH مطلوب اسیدی بوده و بر روی سوبستراهای کاملاً متفاوت اثر می گذاشتند همگی در یک گروه از ذرات سلولی یافت شدند برمبنای اثرات «‌لیز» کنندگی lytic effects)) تمامی این آنزیمها , دید و نام لیزوزوم را برروی آنها نهاد . متعاقباً تعداد زیادی از آنزیمهای دیگر در لیزوزومها از قبیل پروتئینها, پلی ساکاریدها , اسیدهای نوکلئیک و لیپیدها در سلول بودند( جدول 2-8)

نکته جالب اینکه دید و موجودیت لیزوزومها را به طور کامل بر مبنای مطالعات بیوشیمیایی تشخیص داد ولی در سال 1955 یکی از همکاران وی به نام نویکوف (Noviloff) جز سانتریفیوژی غنی از اسید فسفاتاز را با میکروسکوپ الکترونی گذاره مطالعه نمود و اولین ثبوت مورفولوژیکی که وجود لیزوزومها را جدای از میتوکندریها به اثبات می رسانید را ارائه نمود .

در سالهای اخیر , متدهای پیچیده سانتریفیوژی برای بدست آوردن جز هایی با درصد لیزوزم بسیار بالا به کار گرفته شده اند. با سانتریفیوژ تمایزی , جز های لیزوزومی همیشه محتوی مقادیری میتوکندری نیز می باشند. اگرچه میانگین ضریب رسوب میتوکندریها بیشتر از لیزوزومها است , ولی میتوکندریها بنابه اندازه متفاوتی که دارند , انواع کوچکترشان الزاماً همراه لیزوزومها رسوب می نمایند . ضریب رسوب پراکسی زومها است , ولی میتوکندریها بنا به اندازه متفاوتی که دارند , انواع کوچکترشان الزاماً همراه لیزوزومها رسوب می نمایند . ضریب رسوب پراکسی زومها تقریباً مشابه لیزوزومها رسوب می نمایند. ضریب رسوب پراکسی زومها تقریباً مشابه لیزوزمها می باشد و در بافت هایی که پراکسی زوم نیز وجود دارد , جداسازی جز لیزوزومی به طور خالص تقریباً غیر ممکن است و حتماً مقداری پراکسی زوم نیز با آن مخلوط می شود. با به کارگیری سانتریفیوژ شیب غلظت هموزنی در مراحل آخر جداسازی , موفقیتهای بیشتری در امر بدست آوردن جز خالص تر لیزوزومی حاصل شده است , زیرا دانسیته تعادل لیزومها (1.22 g/cm3) , میتوکندریها (1.19g/cm3)و پراکسی زومها (1.23-1.25g/cm3) در شیب سوکروز به مقدار جزئی با هم تفاوت دارند . تمامی روشهای شیب غلظت که برای جداسازی لیزومها مورد استفاده قرار می گیرند , بر مبنای تکنیکی است که توسط اشنیدر (W.C.Schbneider) ابداع گردیده , که بر حسب مورد با تغییرات مقتضی به کار گرفته می شوند ( شکل 1-8) در این روش اکثر میتوکندریها در منطقه 1.19g/cm3 متوقف می گردند. در صورتی که لیزوزمها در منطقه 1.22 g/cm3 تشکیل نوار مستقلی را می دهند .

خالص ترین لیزوزومها از بافت های جانوری که قبلاً‌توسط تریتون WR-1339 , دکستران (Dextran) و توروتراست (Thorotrast) تیمار شده اند قابل دستیابی می باشند . مقادیر زیادی از این ترکیبات سریعاً توسط لیزوزمهای سلولی جذب شده ودانسیته آنها را به نحو قابل ملاحظه‌ای تغییر می دهد . برای مثال , جذب تریتون WR-1339 میانگین دانسیته لیزوزمها را از 22/1 به 10/1 کاهش می دهد . نکته جالب توجه این است که , اگرچه دانسیته لیزوزمها پس از کاربرد تریتون به نحو مؤثری کاهش می یابد , اندازه آنها بزرگتر می شود که در نتیجه آن لیزوزمهای حاوی تریتون دارای ضریب رسوبی همانند لیزوزومهای نرمال ولی دانسیته کمتر می ‌گردند .

چون آنزیمهای لیزوزومی توسط غشایی محصور بوده , و فقط در صورت پاره شدن این غشا می توانند برروی سوبسترا اثر بگذارند , لیزوزوم هستند معمولاٌ قبل و بعد از کاربرد روشهایی که به شکسته شدن غشا لیزوزومها منجر گردد آنها را در مجاورت سوبسترای مناسب قرار می دهند. چون اکثر سوبستراهای هیدرولازهای لیزوزومی قادر به عبور از غشا آن نبوده , بنابراین لیزوزومها تا زمانی که سالم باشند فعالیتی نداشته ولی با بکارگیری روشهایی از قبیل سونیفیکاسیون , انجماد و ذوب کردنهای پی در پی, اضافه نمودن ترکیبات لیزکننده مانند , نمکها , دیجیتونین , تریتون x-100و... غشا محدود کننده آنها پاره شده و محتویات آنزیمی آنها آزاد می گردد. دراین شرایط اگر سوبسترایی اضافه نماییم سریعاً هیدرولیز می گردد .

ساختمان و شکل لیزوزمها

لیزوزومها از نظر ساختمانی ناهمگن بوده و اندازه و مورفولوژی بسیار گوناگون و متفاوتی را دارا می باشند و به همین دلیل شناسایی لیزوزمها صرفاًٌبر مبنای معیارهای مورفولوژیکی مقدور نمی باشد . دید و نویکوف جز های سانتریفیوژی غنی از لیزوزوم را با میکروسکوپ الکترونی مطالعه نمودند و ذراتی که گمان می رفت لیزوزومها باشند را به اندازه یک میتوکندری کوچک دیدند که قطری برابر 1/0 تا 8/0 میکرون داشته و توسط یک غشا احاطه شده بودند و تاحدودی متراکم نسبت به الکترون به نظر می رسیدند , شناسایی لیزوزومها در مقاطع سلولی کاریست به مراتب مشکل تر زیرا ارگانل های کوچک متراکم دیگری نیز یافت می شوندکه توسط یک غشا محصور شده اند .

جدول2-8-بعضی از آنزیمهای موجود در لیزوزومها

آنزیم

سوبسترا

پروتئازها و پپتیدازها

کاتپسین E,D,C,B,A

پروتئینها و پپتیدهای گوناگون

کلاژناز

کلاژن

آریل آمیداز

آریل آمیدها

پپتیداز

پپتیدها

نوکلئازها

اسید ریبونوکلئاز

RNA

اسید دی اکسی ریبونوکلئاز

DNA

فسفاتازها

اسید فسفاتاز

مونواسترهای فسفات

فسفودی استراز

اولیگونوکلئوتیدها , فسفودی استرها

فسفوتیدیک اسید فسفاتاز

فسفاتید یک اسیدها

آنزیمهای اثر کننده برروی زنجیره های کربوهیدارتی گلیکوپروتئینها و گلیکولیپیدها

بتا- گالاکتوزیداز

بتا – گالاکتوزیدها

استیل هگزوزآمینیداز

استیل هگزوآمینیدها , سولفات هپارین

بتا – گلوکوزیداز

بتا- گلوکزیدها

آلفا- گلوکوزیداز

گلیکوژن

آلفا – مانوزیداز

آلفا- مانوزیدها

سیالیداز

مشتقات سیالیک اسید

آنزیمهای اثر کننده برروی گلیکوزآمینوگلیکان

لیزوزیم

موکوپلسی ساکاریدها , دیواره سلولی باکتریها

هیالورونیداز

هیالورونیک اسید , کندرونیتین سولفات

بتا- گلوکورونیداز

پلی ساکاریدها, موکوپلی ساکاریدها

آریل سولفاتاز B,A

آریل سولفاتها , سولفات سربروزید , کندروئیتین سولفات

آنزیمهای اثر کننده برروی لیپیدها

فسفولیپاز

لسیتین , فسفاتیدیل اتانول آمین

استراز

استرهای اسید چرب

اسفنگومیلیناز

اسفنگومیلین

کاربرد روشهای سیتوشیمیایی در سطح میکروسکوپ الکترونی که در آن لیزوزومها بر مبنای محتویات آنزیمی آنها شناسایی می شوند بسیار معتبرتر می باشد. در میان این روشها , روشی که گموری ( Gomori) در سال 1952 ارائه نموده قابل توجه می‌باشد و لیزوزومها را بر مبنای وجود مقادیر زیاد اسید فسفاتازآنها شناسایی می‌نمایدودر روش گسوری بافتی را که باید مورد آزمایش قرار گیرد در محیطی با pH,معادل 5 و بتا – گلیسروفسفات( ) که سوبسترایی برای اسید فسفاتاز یم باشد و یک نمک سرب مانند نتیرات سرب انکوبه می نمایند فسفاتی که به طریقه آنزیمی از سوبسترا داشته می شود با یونهای سرب ترکیب شده و فسفات سرب که غیر محلول می باشد را تشکیل داده که در محل فعالیت آنزیم ( داخل لیزوزوم ) رسوب می نماید . چون فسفات سرب نسبت به الکترون متراکم می باشد , لذا در زیر میکروسکوپ الکترونی لیزوزومها به صورت اجسام تیره گرانولار دیده می‌شوند(شکل2-8) برای شناسایی بامیکروسکوپ نوری از سولفید آمونیوم استفاده می‌شود تا فسفات سرب را به سولفید سرب تبدیل نماید که به صورت تیره قابل مشاهده می باشد.

چندین حالت مختلف لیزوزومی درسلولها شناسایی شده اندکه عبارتند از :

1- لیزوزوم اولیه (Premary lysosome)

2- لیزوزوم ثانویه (secondary lysosome)

3- اجسام رسوبی یا پس مانده (residual bodies)

شکل1-8- مراحل جداسازی لیزوزومها که در آن روشهای سانتریفیوژ تمایی و شیب غلظت به طور توأم به کار گرفته شده است

لیزوزومهای اولیه – به این گروه از لیزوزومها پروتولیزوزوم (protolysosme) هم گفته می شود و ارگانل هایی هستند که توسط یک غشا محصور بوده وتازه ازقسمت ترانس –گلژی جداشده اند.اگرچه اندازه آنها متفاوت می باشد ولی لیزوزوم اولیه تیپیک درحدود 100 نانومتر قطر داشته و ذراتی دست نخورده می باشند بدین معنی که آنزیمهای آنها هنوز در واکنش های هیدرولیتیک شرکت نکرده اند.

لیزوزو ثانویه- دونوع متفاوت ازلیزوزومهای ثانویه را می توان شناسایی نمود

1- واکوئولهای هترو فاژیک (heterophagic vacuoles) که به هترو لیزوزوم یا فاگولیزوزوم نیز مرسوم می باشند و

2- واکوئولهای اتوفاژیک که اتولیزوزوم نیز نامیده می شوند.واکوئولهای هتروفاژیک به وسیله اتصال لیزوزوم اولیه باواکوئولهای سیتولاسمی که حاوی مواد خارج سلولی بوده وتوسط یکی از انواع متنوع پروسه های آندوسیتوزی به داخل سلول راه یافته اند ,تشکیل می گردد.

شکل2-8- فتومیکروگراف الکترونی از گروهی که از لیزوزمها , این گروه های لیزوزومی اغلب در نزدیکی میتوکندریها مشاهده می گردند .

پس از اتصال هیدرولازهای لیزوزوم اولیه به داخل آندوزوم ترشح شده وباعث هضم محتویات آنها می گردد واکوئولهای اتوفاژیک حاوی اجزایی می باشند که از سیتو پلاسم خود سلول جدا گشته اند وممکن است شامل میتوکندریها,میکروبادیها و قطعات شبکه آندوپلاسمی صاف وخشن باشند. هضم ارگانل های سلولی یک پدیده طبیعی است که درخلال رشد وترمیم و علی الخصوص دربافت های درحال تمایز, رایج ومتداول می باشند.

واکوئولهای اتوفاژی که محتوی میتوکندیهای نیمه هضم شده می باشنددرشکل 3-8 نشان داده شده اند پس از تشکیل واکوئولهای هتروفاژیک واتو فاژیک هضم آنزیمی سریعاً شروع می گردد و همانطوری که هضم ادامه می یابد به خاطر تغییرات حاصله,لیزوزوم ثانویه در این مرحله به صورت واکوئول هضمی (digestive vacuole) شناسایی می گردد.

لینک کمکی