فایل word بررسی ایمنی زایی ژن های L7L12 و P39 در موش های Balac

فصل دوم
هدف از این تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac است. بنابراین پس از جداسازی و تکثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.
1- لکون نمودن ژنهای فوق در یک ناقل انتقال دهنده Cleaning vector
2- تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L7/L12
3- کلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان کننده پروکاریونی Procaryotic expression vector
4- تولید و تخلیص پروتئینهای L7/L12 و P39
5- کلون نمودن آنها در پلاسمید بیان کننده اوکاریوتی Eucaryotic expression vector
6- هاری کردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوکسین
7- تزریق پلاسمیدها, بسویه واکنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C
8- سنجشهای ایمونولوژیک
باکتریها و پلاسمیدهایی که برای انجام این پایان نامه استفاده دشه اند بترتیب زیر می باشند:
باکتریها: بروسلاآبورتوس سویه های 19S و 544 اشدیشیالکی سویه  
اشریشیالکی سویه BL21 – اشریشیاکی سویه BL21(DE3(Plyss
پلاسمیرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) - Pblue Script-PCDNA3
-    جداسازی کروموزوم بروسلا آبورتوس 19S:
برای تکثیر ج داسازی ژنهای L7/L12 و P39 ابتدا کروموزوم باکتری جداسازی گردید.
مواد:
بافر TE:
Tris – Hel        10mm
EDTA        1.0mm
‍PH بافر را پس از تهیه برروی 8 تنظیم می نمائیم.
پروتئیناز K:

CTAB/NaCl:
Nacl            4.1gr
CTAB        10gr
DDW            100ml (Final Volume)
روش:
ابتدا محیط برنسط برات را تهیه و استریل نموده و ml5 از محیط را با بروسط آبورتوس سویه 19S تلقیح می نمائیم. پس 48 تا 72 ساعت باکتریها رشد کرده و کدورت مناسبی را پیدا می کند. بقیه مراحل تخلیص کروموزوم بشرح زیر است:
1- 5/1 میلی لیتر از سوسپاستیون فوق را مدت 2 دقیقه در rpm5000 سانتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را دور می ریزیم.
2- Ml576 از بافر TE را بر روی رسوب باکتری اضافه کرده و رسوب را در بافر حل می نمائیم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئیناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت یکساعت در دمای 0C37 نگهداری می نمائیم.
3- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بمیزان Ml80 اضافه کرده و بمدت 10 دققیق در  0C65 انکوبه می کنیم.
4- هم حجم مخلوط بالا از ترکیب کلروفرم – ایزوآمیل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در rpm10000 سانترفوژ می کنیم. محلول رویی را به لوله دیگر منتقل می نمائیم.
5- هم حجم محلول روئی ترمیب فنل – کلروفرم – ایزوآمیل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در vpr10000 سانتریفوژ کرده و محلول رویی به لوله دیگری منتقل می نمائیم.
6- هم حجم محلول روئی ایزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط می کنیم. پس از چند دقیقه DNA کروموزومی ته نشین شده که می توان بات یک پیپت پاستور آنرا جمع آوری نمائیم.
7- رسوب DNA کروموزومی را با الکل 70% شستشو داده و پس از خشک شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل می نمائیم.
بررسی کمی و کیفی DNA کروموزومی:
برای تعیین خلوط کروموزوم باکتری از مواد و وسایل زیر استفاده میشود.
 
1- بافر PBE   pH=8(10X)
Tris – base                 890mM
Boric Acid                890mM
EDTA                25mM
2- آگارز MP
3- تانک الکتروفورز افقی
روش:
ابتدا آگارز MP در بافر TBE(0.5x) را بکمک حرارت حل کرده و ژل آگارز افقی را سینی مخصوص تانک الکتروفورز افقی تهیه می نمائیم. سپس به مقدار Ml5 از DNA کروموزومی را در چلهک ژل ساخته شده ریخته و در تانک الکتروفورز حاوی بافر TBE(0.5x) پس از برقراری جریان الکتریکی مستقیم الکتروفورز می کنیم.
بریا تعیین مقدار DNA نیز پس از تهیه رقت   تز کروموزوم DD آنرا در (Optimal Density) طول موج 260 نانومتر اندازه گیری می نمائیم. مقدار DNA بر اساس فرمول:عکس رقت   50   DD قرائت شده = مقدار DNA تعیین می گردد.
- مرحله پس از جداسازی کروموزوم تکثیر و جداسازی ژنهای مورد نظر است. این فرآیند با استفاده از دستگاه PCR انجام می گردد. در دستگاه PCR با استفاده از عوامل پایه ای, ژن مورد نظر را می توان با استفاده از آنزیم تک پلی مرآز Tag Polymerase تکثیر نمود. عوامل پایه ای ذکر شده شامل موارد ذیل است.
1- قالب
2- پرایمر جلو Forward
3- پرایمر عقب Revers
4- دروکسی نوکلئوتیدها LNTP
5- منیزیوم
6- بافر
7- آنزیم پلی مرآز
8- آب مقطر استریل
برای تهیه پرایمرها ابتدا باید آنها را طراحی کرد. برای طراحی پرایمرهای ژن L7/L12 و P39 ابتدا مترادف نوکلئوتیدی ژنهای فوق را از مرکز اطلاعاتی NCBI بدست می آوریم.
accession No(L7/L12). L27819
accession No(P39). L35038
سپس بر این اساس و درنظر گرفتن نکات استاندارد طراحی پرایمر از جمله طول پرایمر, دمای اتصال G+C%, تولید پرایمر, تولید لوپ یا حلقه و ... ترادف پرایمرهای تعیین میگردد. در این مرحله از آنالیزهای کامپیوتری توسط برنامه Dlogo و Blast استفاده میگردد.
ترادف ژن مورد نظر و پرایمرهای Forward و Reverse برای جداسازی ژنهای فوق از باکتری بروسلا به شرح زیر است: